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FlowJo 是一款專門用于流式細(xì)胞分析的軟件，兼容幾乎所有流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)，能夠通過圖像分析細(xì)胞的各種特征和變化。FlowJo 的用戶界面友好且功能強(qiáng)大，提供了豐富的二維圖表來進(jìn)行系統(tǒng)分析，以幫助用戶輕松監(jiān)測細(xì)胞狀態(tài)的變化。該軟件配備了流動室、液流驅(qū)動系統(tǒng)、光電轉(zhuǎn)換器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等先進(jìn)科技。

FlowJo功能

1. 單標(biāo)樣本

對于單標(biāo)記樣本，常用的數(shù)據(jù)顯示方式是單參數(shù)直方圖。通常情況下，橫坐標(biāo)表示檢測的熒光或散射光的強(qiáng)度，可以設(shè)置為線性或?qū)?shù)標(biāo)度；縱坐標(biāo)則表示在特定熒光強(qiáng)度下的細(xì)胞數(shù)量，有時也會以相對百分比的形式顯示。

例如，分析3 color comp 文件夾中的CyPE comp.fcs數(shù)據(jù)。將該文件夾拖到FlowJo的組空間中。

在組空間中選擇“3 color comp”組，所有樣本將會在樣本空間中顯示。然后雙擊“Cy5PE comp.fcs”，打開圖形窗口。

在此二維點(diǎn)圖中，X軸選擇SSC（側(cè)向散射，細(xì)胞內(nèi)部顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，SSC值越大）；Y軸選擇FSC（前向散射，細(xì)胞越大，F(xiàn)SC值越大）。

使用設(shè)門工具（矩形門、橢圓門、多邊形門、自動門）中的任意一個，在二維點(diǎn)圖中選擇淋巴細(xì)胞。

在圖形窗口中雙擊選中的淋巴細(xì)胞，將生成新的圖形窗口。X軸選擇Cy5PE:CD4，Y軸選擇Histogram，使用設(shè)門工具（區(qū)域門、雙分門）中的任意一個在單參數(shù)直方圖中設(shè)置門。

2. 多色標(biāo)樣本

多色標(biāo)記樣本包括雙標(biāo)記、三標(biāo)記等。橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別代表與細(xì)胞相關(guān)的兩個獨(dú)立參數(shù)，每個平面上的點(diǎn)表示具有相應(yīng)坐標(biāo)值的細(xì)胞。

以三標(biāo)記樣本為例，分析3-color-experiment文件夾中的931115-B02-Sample01.FCS數(shù)據(jù)。雙擊樣本以打開圖形窗口，顯示為二維點(diǎn)圖。X軸選擇FSC，Y軸選擇SSC。接著使用多邊形設(shè)門工具，在二維點(diǎn)圖中選擇淋巴細(xì)胞。

雙擊淋巴細(xì)胞門，打開圖形窗口，X軸選擇Fluor::CD3，Y軸選擇FSC。使用矩形設(shè)門工具選中CD3陽性細(xì)胞，并將其命名為T細(xì)胞。

再次雙擊T細(xì)胞門，出現(xiàn)圖形窗口，X軸選擇Cy5PE::CD4，Y軸選擇PhyEry::CD8，使用十字門工具進(jìn)行設(shè)門（拖動鼠標(biāo)調(diào)整四分門位置，通常設(shè)置在陰性和陽性細(xì)胞的分界處），如下圖所示：

Q1：CD8單陽性細(xì)胞，即CD8+ T細(xì)胞

Q2：雙陽性細(xì)胞

Q3：CD4單陽性細(xì)胞，即CD4+ T細(xì)胞

Q4：雙陰性細(xì)胞

3. 細(xì)胞凋亡

拖入凋亡樣本，雙擊打開圖形窗口，X軸選擇FSC-A，Y軸選擇SSC-A。選擇上圖所示的細(xì)胞群體進(jìn)行凋亡分析，細(xì)胞碎片不予分析。

在SSC/FSC圖中雙擊“分析的細(xì)胞群體”，X軸選擇FITC以表示AnnexinV-FITC，Y軸選擇PE-Texas以表示PI。使用四分門工具界定活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，如下圖所示：

Q1：(AnnexinV-FITC)-/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞，也可能包含一些晚期凋亡細(xì)胞和機(jī)械損傷細(xì)胞。

Q2: (AnnexinV+FITC)+/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。

Q3：(AnnexinV-FITC)+/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。

Q4：(AnnexinV-FITC)-/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。

通常統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率時，計(jì)算Q2+Q3，即晚期凋亡加早期凋亡細(xì)胞群（即所有AnnexinV陽性群）。

4. 細(xì)胞周期

細(xì)胞周期檢測是流式細(xì)胞儀的一項(xiàng)重要應(yīng)用，指的是細(xì)胞從親代分裂完成到子細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。細(xì)胞周期包括G1期、S期、G2期和M期。細(xì)胞在G1期完成生長和物質(zhì)準(zhǔn)備，在S期完成DNA的復(fù)制，在G2期進(jìn)行檢查和修復(fù)，以確保DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性，最后在M期進(jìn)行分裂。

在細(xì)胞周期檢測中，PI（碘化丙啶）作為一種常用的染料，通過嵌入DNA和RNA雙鏈之間來標(biāo)記細(xì)胞，其結(jié)合量與DNA含量成正比。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到各個周期階段的DNA分布狀態(tài)，并計(jì)算每個階段的百分比。

以cell cycle 文件夾中的5206.001 PI標(biāo)記數(shù)據(jù)為例，選擇目標(biāo)細(xì)胞群體并排除細(xì)胞碎片。雙擊5206.001樣本，打開圖形窗口。X軸選擇FSC-H，Y軸選擇SSC-H，細(xì)胞碎片位于左下角，設(shè)門選中目標(biāo)細(xì)胞，如下圖：

選擇要進(jìn)行細(xì)胞周期分析的單細(xì)胞群體，排除粘連細(xì)胞的影響。X軸選擇FL2-W（寬度），Y軸選擇FL2-A（面積），設(shè)門方式如下圖所示：

對于BD流式儀采集的數(shù)據(jù)，通常使用FL2-A與FL2-W（或FL2-A與FL2H）進(jìn)行設(shè)門。

對于Beckman流式儀采集的數(shù)據(jù)，X軸選擇FL3-LIN來表示PI的線性信號，Y軸選擇FL3-PEAK來表示PI的峰值信號，設(shè)門方式如下圖：

在FlowJo工作臺中選擇“單細(xì)胞群體”節(jié)點(diǎn)，點(diǎn)擊菜單欄中的“工具”，選擇“細(xì)胞周期”，打開周期分析窗口。得到G1期、S期、G2期細(xì)胞的百分比數(shù)據(jù)，以及G1期和G2